芝麻素减轻自发性高血压大鼠肾脏纤维化作用及其机制讨论论文

　　原发性高血压是发病率较高的常见疾病。发病率呈逐年上升趋势，若不及时治疗，可发展为慢性肾衰竭或尿毒症而危及生命。目前，高血压肾病机制尚不十分清楚，其主要的病理改变为肾间质纤维化与肾小球硬化。其中肾间质纤维化是决定肾脏疾病发展和预后的重要因素，是所有原发或继发慢性肾脏疾病进展至终末期肾衰竭的共同途径。芝麻素( sesamin，Ses) 是从芝麻中提取出来的有效活性成分，具有调节血压、血脂，保护与改善肝肾功能及抗肿瘤等药理作用。本课题组前期研究已证实，Ses 具有减轻自发性高血压大鼠肾损伤的保护作用，但深入的机制尚不清楚。本实验以自发性高血压大鼠( SHR) 为研究对象，探讨Ses 减轻大鼠肾脏纤维化的作用及其可能存在的机制。

　　1 材料与方法

　　1. 1 药品和试剂

　　芝麻素( 分子式C20H15O6，相对分子质量354. 34，纯度≥98%) ，购自上海纯优生物科技有限公司; 卡托普利片( 批号:13030711) ，购自常州制药厂有限公司; 丙二醛( MDA) 、超氧化物歧化酶( SOD) 、BCA( bicinchoninicacid) 蛋白浓度检测试剂盒、α-平滑肌肌动蛋白( α-SMA，批号: AA132) 抗体均购自碧云天生物技术研究所; 转化生长因子-β1( TGF-β1，批号:BA0290 ) 、基质金属蛋白酶-9 ( MMP-9，批号:BA2202) 、基质金属蛋白酶的组织抑制剂-1( TIMP-1，批号: BA3727) 抗体均购自武汉博士德生物工程有限公司。

　　1. 2 仪器

　　ALC-NIBP 无创尾动脉血压测定分析系统( 上海奥尔科特生物科技有限公司) ; DYCP-34A 型电泳槽、DYY-Ⅲ-8B 稳压稳流电泳( 北京六一仪器厂) ; Mini PROTEAN 转膜系统、MiniPROTEAN 电泳系统( 美国Bio-Rad 公司) ; CS-15台式离心机( Beckman Coulter) ; SIEMENS RXLMAX全自动生化仪( 上海西门子有限公司) 。

　　1. 3 实验

　　动物及分组10 周龄雄性SHR 大鼠28 只，WKY 大鼠7 只，体质量180 ～ 200 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号为SCXK ( 沪) 2012-0002， 合格证号为2007000552035。大鼠每4 只1 笼进行饲养，自然光照，室温( 23 ± 2) ℃，相对湿度60% ～ 65%，动物可自由进食饮水。SHR 大鼠适应性喂养3周后，随机分为4 组: 模型( SHR) 组、芝麻素低、高( 80、160 mg /kg) 剂量组及卡托普利( 30 mg /kg)组，以同周龄WKY 大鼠作为对照组。按上述设定剂量灌胃给药，每日一次，连续12 周。

　　1. 4 测量

　　血压采用尾动脉无创测压法。在干燥、安静的环境中，将清醒状态下的大鼠放置于37 ℃ 恒温袋内预热15 min，用ALC-NIBP 无创血压计测量尾动脉舒张压，在大鼠安静状态下连续测定3 次，每次间隔1 ～ 2 min，取其平均值。

　　1. 5 生化指标检测

　　全自动生物化学分析仪测定各组大鼠血清肌酐( Scr) 、尿素氮( BUN) 和尿微量白蛋白( U-mAlb) 含量; 黄嘌呤氧化酶法测定SOD; 硫代巴比妥酸法测定MDA。具体方法、操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

　　1. 6 肾脏病理学变化

　　观察给药12 周后， 10%水合氯醛( 0. 33 g /kg，i . p. ) 麻醉各组大鼠，取肾脏组织，置入4%多聚甲醛溶液中固定48 h 后，常规石蜡包埋、切片、脱蜡、水化等，进行HE 和Masson染色，光镜下观察肾脏病理学变化。

　　1. 7 免疫组织化学法测

　　TGF-β1、α-SMA 阳性细胞的表达按照厚度约为5 μm/片的标准将各组大鼠肾脏石蜡横断面连续切5 ～ 6 片，切片常规脱蜡至水。严格按照免疫组化试剂盒说明书操作。将免疫组化染色的切片在光镜下统一放大10 ×40 倍，采用Image-pro plus 图像分析软件进行半定量分析，将每只大鼠肾组织染色切片各取5 个相同单位面积的区域，棕黄色颗粒为阳性细胞，测定TGF-β1及α-SMA 阳性细胞的积分光密度值( IOD) ，计算其平均积分光密度值( AIOD) 。

　　1. 8 Western blot 测TGF-β1、α-SMA、MMP-9、TIMP-1 蛋白的表达

　　RIPA 裂解液裂解肾组织，提取细胞总蛋白，BCA 法测蛋白浓度，每孔上样50 μg 蛋白，SDS-PAGE( 12%) 电泳分离样品。电泳后的蛋白转移至PVDF 膜上，室温下封闭液封闭1 h，一抗孵育( 4 ℃) 过夜。然后用洗涤液洗膜10 min × 3 次，再将膜浸入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG( H + L) ( 1∶ 2 000) 中，室温下孵育60 min，洗膜10 min × 3 次，ECL 发光显色，曝光、显影及定影，采用Image J 1. 43 软件进行数据处理，条带强度用集成光密度值表示。( 目的蛋白集成密度值/β-actin 集成密度值) 为目的蛋白表达强度。

　　1. 9 统计学处理结果

　　采用SPSS 13. 0 软件进行分析，所有数据均以均数± 标准差( x ± s) 表示，2 组间比较，方差不齐用t&＃39; 检验，方差齐用非配对t 检验，多组比较采用单因素方差分析( ANOVA)分析。P < 0. 05 为组间差异具有统计学意义。

　　2 结果

　　2. 1 芝麻素对SHR 大鼠舒张压的影响给药前，各组SHR 大鼠舒张压均明显高于正常组( P< 0. 01) 。当模型组大鼠给药治疗后，在12 周内其舒张压随时间的延长逐渐下降，尤其在给药第8 周后，与模型组比较，芝麻素各剂量组与卡托普利组大鼠舒张压明显下降( P < 0. 01) 。提示芝麻素具有一定降低SHR 大鼠血压的作用。

　　2. 2 芝麻素对SHR 大鼠生化指标的影响与正常组比较，模型组大鼠Scr、BUN、U-mAlb 及MDA含量明显升高，SOD 水平显著降低( P < 0. 01) 。与模型组相比，芝麻素低、高剂量组及卡托普利组Scr、BUN、U-mAlb、MDA 含量均显著下降，SOD水平明显提高( P < 0. 05，P < 0. 01) ，其中芝麻素高剂量组与卡托普利组效果更明显 。提示芝麻素具有减轻SHR 大鼠肾损伤的作用，可能与其抗氧化应激作用有关。

　　2. 3 芝麻素对SHR 大鼠肾脏形态学的影响正常组肾小球和肾小管结构均正常。与正常组比较，HE 结果显示模型组大鼠肾小球系膜区基质增多，肾小管上皮细胞出现颗粒变性伴萎缩，肾间质发生纤维化伴淋巴-单核细胞浸润; Masson 染色结果显示肾小球系膜区与肾小管周围出现大量蓝染胶原沉积，纤维增生和间质纤维化。与模型组相比较，用药组HE、Masson 染色均显示肾小球系膜基质增生和肾小管上皮细胞变性明显减少，胶原沉积和肾间质纤维化程度显著减轻。提示芝麻素具有一定改善SHR 大鼠肾脏纤维化的作用。

　　2. 4 芝麻素对SHR 大鼠肾组织TGF-β1、α-SMA 阳性细胞表达的影响正常组大鼠肾小管上皮细胞、基膜和肾间质中，极少表达TGF-β1、α-SMA，仅见很少量的棕黄色颗粒沉积; 模型组TGF-β1阳性细胞表达主要在肾小管上皮细胞，可见大量棕黄色颗粒沉积，α-SMA 阳性细胞表达主要在肾小管基膜及肾间质中，出现大量棕黄色颗粒沉积; 而用药组肾小管基膜、上皮细胞及肾间质中棕黄色颗粒沉积明显减少。半定量分析结果显示，与正常组比较，模型组大鼠肾组织TGF-β1、α-SMA 阳性细胞表达明显增强( P < 0. 01) ; 而与模型组相比，芝麻素、卡托普利能不同程度地减弱大鼠肾组织TGF-β1、α-SMA 阳性细胞表达( P<0. 05，P < 0. 01) 。提示芝麻素具有下调SHR 大鼠肾组织TGF-β1、α-SMA 阳性细胞表达的作用。

　　2. 5 芝麻素对SHR 大鼠肾组织TGF - β1、α-SMA 蛋白表达的影响模型组大鼠肾组织TGF-β1、α-SMA 蛋白表达水平与正常组比较，显著增加( P < 0. 01) ; 而与模型组相比，芝麻素与卡托普利能不同程度地降低SHR 大鼠肾组织TGF-β1、α-SMA 蛋白表达水平，差异具有显著统计学意义( P < 0. 05，P < 0. 01，图4) 。提示芝麻素可下调SHR 大鼠肾组织TGF-β1、α-SMA 蛋白的表达水平。

　　2. 6 芝麻素对SHR 大鼠肾组织MMP-9、TIMP-1 蛋白表达水平的影响与正常组比较，模型组大鼠肾组织MMP-9、TIMP-1 蛋白表达水平增强，尤其是TIMP-1 表达显著增强，MMP-9 /TIMP-1 比值明显降低( P < 0. 01) ; 与模型组比较，芝麻素高剂量组及卡托普利组大鼠肾脏MMP-9、TIMP-1 蛋白表达水平降低，且TIMP-1 表达水平下降更显著，MMP-9 /TIMP-1 比值明显增大( P < 0. 05，P<0. 01) 。提示芝麻素能下调SHR 大鼠肾组织MMP-9 和TIMP-1 蛋白的过度表达，尤其下调TIMP-1 表达更为显著，增大MMP-9 /TIMP-1 比值。

　　3 讨论

　　肾纤维化是高血压的常见并发症之一，是反映肾功能损伤程度的最主要指标。肾纤维化形成的主要机制包括胶原过量聚集、细胞外基质( ECM) 在肾间质过度积聚与沉积、α-SMA 不断活化、成纤维细胞大量增生等。肾纤维化若不积极治疗最终可发展为肾衰竭而危及生命。血管紧张素转换酶抑制剂卡托普利已广泛应用于心衰、高血压及肾脏疾病等治疗。它不仅具有抗脂质过氧化、降低血压等作用，而且能有效降低血肌酐、尿蛋白排泄，改善肾小球血流动力学指标，延缓肾小球硬化等。因此，本实验运用卡托普利作为阳性对照药。

　　实验中，HE 和Masson 染色结果显示，模型组大鼠肾小球系膜区基质伴有增生和胶原纤维沉积，肾小管上皮细胞发生颗粒变性伴萎缩，肾间质出现大量蓝染胶原纤维增生，提示高血压时肾脏发生纤维化。用药后，芝麻素明显改善肾小管及肾间质病变，表明芝麻素可减轻SHR 大鼠肾损伤，该结果与前人报道基本一致。研究还发现给予芝麻素处理后，在12 周内，模型组大鼠舒张压随着治疗时间的延长而降低，尤其在治疗后第8 周下降明显，且以芝麻素高剂量组效果显著，提示芝麻素具有降低SHR 大鼠血压的作用，呈剂量依赖性，其结果与本课题组前人报道一致。UmAlb是高血压早期肾功能损害的检测指标，BUN、Scr 是反映中晚期肾功能改变的常用指标。本实验发现，模型组大鼠U-mAlb、BUN、Scr 含量均显著升高，而芝麻素能明显降低以上指标，尤其是高剂量组效果显著。

　　研究已证实氧化应激反应是高血压肾损伤进展的重要因素之一，持续高血压状态可使氧化应激水平增加，抗氧化活性降低，使活性氧簇的生成显著超过机体清除能力，从而导致机体肾组织结构损伤。MDA 水平反映机体脂质过氧化程度和含量，间接反映细胞受自由基攻击的损伤程度，SOD 属于机体内氧自由基清除酶体系重要成员之一。本研究结果显示，模型组大鼠肾脏MDA含量显著升高，SOD 活性明显降低。与模型组相比，芝麻素组及卡托普利组MDA 含量明显减少，SOD 活性显著升高。提示芝麻素可通过提高肾脏SOD 活性，降低MDA 含量来抑制高血压肾脏过度激活的氧化应激反应。TGF-β1是最重要的促纤维化因子，参与诱导肾脏纤维化过程中的多个环节。大量研究证实，持续高血压状态会导致机体抗氧化活性下降，氧化应激水平增加，促使肾脏细胞发生氧化应激反应，导致活性氧簇生成增多，从而上调一些细胞因子的表达，如TGF-β1、结缔组织生长因子( CTGF)等，进而促使肾小管上皮细胞-间充质细胞转分化成为肌成纤维细胞，而肌成纤维细胞是合成ECM 的主要细胞。α-SMA 是肌成纤维细胞的标志物，在TGF-β1刺激下，α-SMA 会明显活化，表达显著上升; TGF-β1等细胞因子还可促使基质金属蛋白酶类( matrix metalloproteinases，MMPs)及其特异性抑制剂组织金属蛋白酶抑制物( tissueinhibitors of metalloproteinases，TIMPs) 过度表达，引起ECM 过度沉积，抑制蛋白酶生成，减少基质降解等，从而最终导致肾脏纤维化。本研究结果显示，模型组大鼠肾组织TGF-β1、α-SMA 阳性细胞和蛋白表达均显著增加，表明持续高血压状态过度激活TGF-β1、α-SMA 的活性。而给予芝麻素处理后，两者阳性细胞和蛋白表达均明显减少，提示芝麻素可下调SHR 大鼠肾脏过度激活的TGF-β1，进而进一步阻滞α-SMA 活化，从而抑制肾小管上皮细胞-间充质细胞转分化为肌成纤维细胞，有效遏制肾脏纤维化的进程。

　　MMPs /TIMPs 是参与肾脏细胞外基质降解的重要酶系统，其活性变化对于维持肾脏ECM 生成与降解的动态平衡十分重要。文献报道，在持续高血压状态下，过度激活的TGF-β1可与肾小球高压相互作用，促使肾组织ECM 降解系统尤其是MMPs /TIMPs 功能紊乱，引起两者过度表达或平衡失调，抑制ECM 降解，促进其生成，从而最终导致肾间质纤维化。MMPs 能水解ECM 中的各种蛋白成分，其活化被认为是ECM 降解的限速关键环节，其中MMP-9 主要降解胶原与明胶等，从而缓解肾间质纤维化。TIMP-1 是MMP-9 特异性抑制剂，正常情况下MMP-9 与TIMP-1 按1∶ 1比例释放，两者共同维持ECM 生成与降解的平衡。有研究表明，肾硬化等ECM 增多的疾病中均有TIMP-1 过度表达或MMP-9 /TIMP-1 比值降低。本实验结果发现，模型组大鼠肾组织MMP-9、TIMP-1 表达均增强，且TIMP-1 表达增强较MMP-9 更为显著，MMP-9 /TIMP-1 比值明显降低，与前人文献报道结果一致。而给予芝麻素处理后，MMP-9、TIMP-1 表达均减弱，但TIMP-1表达减弱较MMP-9 更明显，MMP-9 /TIMP-1 比值显著升高。提示持续高血压状态下，肾脏TGF-β1表达增多，促使MMP-9 与TIMP-1 过度表达或失衡，尤其是TIMP-1 表达显著增强，从而进一步加重肾组织肾间质纤维化进程。而芝麻素能有效下调MMP-9 及TIMP-1 在肾组织的过度表达，尤其下调TIMP-1 表达更显著，上调MMP-9 /TIMP-1，恢复MMP-9 与TIMP-1 间的平衡，减少细胞外基质积聚与沉积，从而减轻肾脏纤维化。综上所述，本课题组推测芝麻素可能是通过其降压和抗氧化应激反应，抑制TGF-β1过度激活，进而阻滞α-SMA 活化，下调TIMP-1 过度表达，上调MMP-9 /TIMP-1，恢复MMP-9 与TIMP-1间平衡，从而减少胶原过量聚集、ECM 在肾间质过度积聚及成纤维细胞大量增生等，发挥减轻自发性高血压大鼠肾脏纤维化作用。但其深入而全面的机制还有待于进一步研究。